微生物的測定——顯微鏡法
2021-09-16 13:22:32
天緯化學(xué)小編
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如何測定微生物的數(shù)量對于微生物研究至關(guān)重要，目前最常用的方法包括顯微鏡法、平板計數(shù)法、分光光度法、流式細(xì)胞法等，各有優(yōu)缺點，本文首先介紹顯微鏡法。細(xì)胞數(shù)量可以通過簡單的顯微鏡觀察和計數(shù)進行測定。顯微鏡計數(shù)可以對玻片上干燥的樣品或液體樣品進行計數(shù)。干燥的樣品可以染色，以增加細(xì)胞與其背景之間的對比。對于液體樣品，計數(shù)室由刻蝕在載玻片表面的已知面積的正方形網(wǎng)格組成。在顯微鏡下，單位面積網(wǎng)格上的細(xì)胞數(shù)量可以數(shù)出來，每毫升懸浮液的細(xì)胞數(shù)就能簡單計算出來(如下圖所示)。顯微計數(shù)是一種快速簡便的微生物細(xì)胞數(shù)量估算方法，但存在以下問題：如果沒有特殊的染色技術(shù)，就無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞；實驗的再現(xiàn)性一般；小小的細(xì)胞往往很難看的清楚，這可能導(dǎo)致計數(shù)不準(zhǔn)；如果細(xì)胞懸浮液的密度低(少于106個細(xì)胞/毫升)，視野中將幾乎沒有細(xì)胞；對于運動的細(xì)胞，觀察前需要將其殺死(通常用甲醛)或固定；樣品中的雜質(zhì)會產(chǎn)生誤導(dǎo)。對細(xì)胞進行染色是常見的研究手段。例如，DAPI(4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)能夠染色所有細(xì)胞，因為它能夠穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生比自身強20多倍的熒光，DAPI染劑利用紫外光激發(fā)，與DNA結(jié)合時最大吸收波長為358 nm，最大發(fā)射波長461 nm；熒光染料PI(碘化丙啶)是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，但染料不能透過細(xì)胞膜，常用于死細(xì)胞的檢測。因此，DAPI/PI染色經(jīng)常組合使用，用于檢測細(xì)胞的生存狀態(tài)。通過將熒光染料附著在特定的核酸探針上，可以制備出對某些生物(群)具有高度特異性的熒光染色劑，這方面用的很多的是熒光原位雜交(FISH)。基于催化特定代謝過程的功能基因的熒光探針也已開發(fā)出來，如果細(xì)胞被這些探針染色，就可以推斷它們具有行使該代謝的能力，對研究微生物生態(tài)很有幫助。
參考資料：
Brock Biology of Microorganisms, 15th Edition
5.6 Microscopic Counts of Microbial Cell numbers
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